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Nanopore測序技術借助單個分子通過納米孔時引起孔兩側電位差來實現信號檢測,納米孔的直徑僅允許單個核苷酸聚合物通過,而ATCG四種堿基以及帶有甲基化修飾的堿基的帶電性質不同,因此通過電信號差異特征即可檢測出通過納米孔的堿基類型,從而實現甲基化修飾的檢測。
Nanopore三代單分子納米孔測序可以同時檢測全基因組范圍單堿基的5mC和6mA修飾位點,并給出單堿基的甲基化水平!甲基化數據的序列信息還可以用于重測序分析,一套數據分析5mC&6mA的甲基化的同時還能進行結構變異檢測。
實驗流程按照 Oxford Nanopore Technologies(ONT) 公司提供的標準 protocol 執行,包括樣品質量檢測、文庫構建、文庫質量檢測和文庫測序等流程。
樣品間比較分析
不可以,必須直接上DNA,如果PCR后堿基上的甲基化修飾會被隱藏掉,無法通過電信號判斷出來。
N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenine,6mA)是指腺嘌呤6位氮原子的甲基化修飾。對于真核生物來講,關于DNA甲基化的研究主要集中在5mC上。然而隨著測序技術的發展發現6mA在真核生物中不但存在還起著非常重要的作用。關于6mA甲基化在發育、疾病中所起的作用還需要大家共同探索。
6mA-IP-seq是研究用6mA的抗體去富集發生甲基化的區域,該技術最后找到的是發生甲基化區域的Peak,而非單堿基分辨率下研究每個A堿基的甲基化狀態。而Nanopore測序根據電信號直接判斷堿基是否發生甲基化修飾,進而根據多條read的信息去計算每個位點的甲基化水平。甲基化水平的變化與基因表達調控密切相關,單堿基分辨率研究位點的甲基化水平的變化對于研究甲基化的功能至關重要。